Для настоящих ценителей. Сравнение методов анализа яда Pterinochilus

ВАЖНО!!
Перевод данной статьи, был заказан один из первых не понимая всей сложности данной темы. Поэтому я не уверен что статья найдет своего читателя, а для тех кто не решит тратить свое время коротко о ней можно прочесть в блоге.

Сравнение методов анализа матрично-активированной лазерной дезорбции/времяпролетной ионизации и жидкостной хроматографии электроспреем ионизации масс-спектрометрии сырого яда тарантула группы Pterinochilus
Пьер Эскабас 1 *, Юлия Чамот-Рук2, Рето Стоклин3, Брайан Дж. Уфйтли4, Джерардо Корзо1, Роджер Дженет2 и Терума Накаджима1 1 Институт Сантори биоорганических исследований, Мисшима-Ган, Шимамото-Чо, Вакаямадай 1-1-1, Осака 618, Япония 2 CEA, Отдел инженерии и исследования белка, 91191 Гиф-сюр-ивет Цедех, Франция 3 Atheris лаборатории, Case Postale 314, СН-1233 Бернех, Женева, Швейцария 4 биопрепараты беспозвоночных, 23529 Терраса ночного вида, Лос Гатос, Калифорния 95033, США

Поиск новых фармакологических средств против яда пауков подразумевает нужду в точных и воспроизводимых методах идентификации видов. В дополнение к морфологическому анализу, мы разработали дактилоскопию яда с помощью хроматографии с обращенной фазой и матрично-активированной лазерной десорбции/ впемяпролетной ионизации — масс-спектрометрии (MALDI-TOFMS) в качестве эффективного и точного инструмента идентификации яда. Для того чтобы сравнить возможное использование жидкостной хроматографии с электрораспылением ионизаций масс-спектрометрии (ЖХ / ESIMS) в качестве дополнительного инструмента характеристики яда, мы применили обе методологии для изучения нескольких образцов яда тарантула в группе Pterinochilus murinus. Эти виды обладают высокой активностью ядов, хотя их таксономия остается сложной. Мы показали, что обе эти методики могут быть успешно применены для описания яда тарантулов. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация — времяпролетная масс-спектрометрия и ионизация электрораспылением масс спектрометрии дали сходные общие очертания и позволили точно дискриминировать образцы. По крайней мере, один образец яда, как было доказано, принадлежащий к одной группе полностью отличается от яда другой группы.

Связывание методов ионизации электрораспылением масс-спектрометрии с разделенной высокоэффективной жидкостной хроматографией дало новое измерение в анализе яда, с четкой дискриминацией компонентов подобного Mr и более точную картину о составе яда, распределение количества молекулярных видов и молекулярного веса. Яд членистоногих это комплекс смеси нейротоксинов, которые были распознаны как потенциальные фармакологические инструменты для описания клеточных рецепторов. Для лучшего понимания молекулярных механизмов передачи сигналов, имеется постоянно увеличивающаяся потребность в новых фармакологических агентах для еще неизвестных клеточных рецепторов. Такие высокого аффинные лиганды, часто встречаются в ядах животных, в результате утонченного эволюционного процесса, который отобрал высоко специфические токсины из природного комбинаторного хранилища.

Яды пауков богатый источник пептидных токсинов, которые находятся в центре внимания из-за открытия их эффектов. Тем не менее, точные и воспроизводимые идентификации живых особей иногда трудно достичь с помощью обычных методов исследования, но является неотъемлемым для воспроизведения биохимических и фармакологических опытов. Масс-спектрометрия чаще используется в последние годы для решения аналогичных проблем, хотя и для создания массовых отпечатков белковых экстрактов или отдельных клеток. Данная методология успешно применяется для идентификации патогенных и непатогенных бактерий. Дактилоскопия пептидов ядов животных от змей, скорпионов и конических оболочек показали полезность масс-спектрометрии в идентификации видов и описании токсинов из сложных биологических матриц.

Мы ранее рассчитали предложенную для точной, быстрой и воспроизводимой идентификации методику для анализа ядов пауков, на основе дактилоскопии пептидов, полученных путем сочетания высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), капиллярного электрофореза (СЕ) и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации — впемяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOFMS). Эта методика в настоящее время регулярно применяется для решения трудных проблем в таксономии или для подтверждения идентичности образца, когда отдельные партии ядов получают из различных источников. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация — впемяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOFMS) имеет преимущество над быстрым смешанным анализом, это чувствительность, быстрая подготовка образца, высокая проходимость проб и возможная комбинация различных матричных систем. Однако, низкая массовая точность не-рефлектронного времяпролетного анализа может затруднить поиск специфических белков в сложной смеси высокогомологичных молекулярных видов.

Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация — впемяпролетная масс-спектрометрия теоретически может предложить более высокое массовое разрешение в режиме рефлектрона, но обычно слишком ограничена в массовом масштабе для анализа сырого яда животных. Были предложены другие подходы к идентификации сложных образцов с использованием жидкостной хроматографии / ионизации электрораспылением – масс-спектрометрии (LC/ESI-MS) или капиллярный электрофорез/ ионизация электрораспылением — массовая спектрометрия (CE/ESI-MS) и их преимущества более высокая массовая резолюция, одновременное фракционирование пробы и единый ионный мониторинг. В целях дальнейшего сравнения потенциальных обоих методологий идентификации и фармакологического анализа ядов пауков, мы предприняли изучение образцов яда у пяти африканских пауков (в совокупности известных как «бабуиновые пауки») группы Pterinochilus.

Оба анализа образцов матрично-активированная лазерная десорбция/ впемяпролетная ионизация (MALDI-TOF) и жидкостная хроматография/ионизация электрораспылением (LC/ESI) выполнялись параллельно, и результаты были использованы для сравнения эффективности, точности и применимости обоих методов к классификации образцов путем исчисляемых параметров, а также возможной идентификации известных составляющих. Виды группы Pterinochilus широко распространены в Восточной Африке, и их таксономия особенно сложна. Образцы, имеющиеся в распоряжении исследователя различны, часто запутывают общие наименования, отражающиеся в итоге на точности классификации и сложности идентификации. Двадцать четыре описанных вида предположительно сводятся к 18, но классификация является источником обсуждения среди специалистов и фактическое количество видов может быть гораздо выше.

Так как яды группы Pterinochilus продемонстрировали сильную биологическую активность и присутствовали потенциально интересные лиганды ионных каналов (П. Эскобас, неопубликованные данные), они представляют собой хорошую модель для применения масс-спектрометрии в идентификации и дактилоскопии яда.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Подготовка образца
Яды тарантулов были получены от содержащихся в лаборатории взрослых женских особей, путем либо электрической стимуляции хелицеры 24 или 12 В переменного тока, или путем погрызания приманки, что описано ранее. Яд, полученный из клыков собирали в пробирки Ependorff и замораживали. Были получены следующие виды Пауков Терапозид: Pterinochilus murinus «Усамбара красный» ‘# 1 (Pmu1), P. murinus «общий окрас» (Pmu2), P. murinus ‘Момбаса’ (Pmu3), P. murinus «Усамбара красный» # (Pmu4), Р. murinus «Тан бабуина» (Pmu5). Названия этих видов отражают коммерческие наименования мест, где торгуют животными, на основе географического происхождения и/или окраски и связанных с ними видов из Кении/Танзании под общим наименованием Pterinochilus murinus или Pterinochilus. Все образцы перед анализом были повторно растворены в дистиллированной водой до 10 раз от первоначального объема яда, их центрифугировали (14000 оборотов в минуту, 40 мин) при 4 ° С для удаления слизистого материала и фильтровали на 0,45 мм микрофильтрами (SJHVL04NS, диаметром 4 мм, Millipore). Яды впоследствии хранили при температуре 20 ° С до анализа. Обращенно-фазовая хроматография Для каждого яда, 10 мл кратного раствора яда (1 мл яд-эквивалент) анализировали на обращенно-фазовой (RP) колонке С8 (Merck Lichrospher, 4,6х125 мм, 5 мм, Merck, США) с использованием линейного градиента ацетонитрила (растворитель B) в воде (растворитель А) с 0,1% трифторуксусной кислотой (ТФУ) (0% В 5 мин, 0-60% B 60 мин, 60-90% B 5 мин, при скорости потока 1 мл / мин) на системе Shimadzu LC6A подключенной к детектору Hewlett-Packard 1050 с диодной матрицей, соединенной с микрокомпьютером Hewlett-Packard работающим на программном обеспечении Chemstation1.
Мониторинг элюирования проводили при 215 и 280 нм. Все растворители сортировались по ВЭЖХ (Nacalai Tesque, Япония).
Капиллярный зонный электрофорез
Анализ капиллярный зонный электрофорез (CZE) проводили на системе Jasco, снабженной УФ-детектором, подключенного к регистратору Shimadzu CR-4A и без покрытия капиллярной колонки силикагелем (0,1 мм внутренний диаметр, 70 см длиной, 50 см до детектора). Для анализа использовали буфер цитрата натрия 20 мМ (рН 2,5) (Applied Biosystems, США). Образцы (1 мл раствора яда 1:10) растворяли в 10 мл мигрирующего буфера и крепились гидродинамически к капилляру (высота 20 см, 15 с). Анализы проводились с 20 кВ постоянного напряжения. Процесс поглощения контролировали при 210 нм. Матрично-активированная лазерная десорбция/ впемяпролетная ионизация масс-спектрометрия Для анализа матрично-активированной лазерной десорбции/ впемяпролетной ионизации было приготовлено 10 мг/мл матричного раствора альфа-циано-4-гидроцинамичной кислоты (альфа-ЦГАК, Алдрич, США), в соотношении 1:1 вода/ацетонитрил включающий 0,1% TFA (трифторукусусную кислоту) (TFA, Никалай Тускве. Япония). Один микролитр раствора яда (0,1 мл яд — эквивалент) смешивают с 9 мл матричного раствора и 1 мл смеси (0,01 мл) яда-эквивалента затем наносят на опорную пластину. Все растворители, использовали в анализе ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) (Nacalai Tesque, Япония). Измерения проводились на спектрометре PerSeptive Voyager Elite (Perseptive биосистемы, США) оснащенным трубкой с двумя пролетными ионами и системой замедленной экстракции. Спектры регистрировали в линейном режиме положительного иона с использованием 337 нм излучения азотного лазера, с ускоряющимся напряжением 20 кВ. Масс-спектры получены путем усреднения 90-120 сканов, используя высокий уровень мощности лазера. Калибровка системы была сделана по каждой серии измерений с использованием смеси B-инсулина (3496,94 Da) и бычьего инсулина (5734,5 Да), и полученный калибровочный ряд будет использоваться во всех последующих измерениях. Новый калибровочный ряд создавали для каждого нового ряда. Обработку масс-спектров проводили с помощью программного обеспечения GRAMS 386 на 486 микрокомпьютерах.
Онлайн LC / ESI-MS Хроматографическое разделение проводили с использованием системы модели 1100 HPLC компании Hewlett-Packard, оснащенной автоматическим инжектором. Колонка с обращенной фазой (Vydac C18, 250х4.6 мм, 300A° частиц) работала при скорости потока 0,6 мл / мин. Растворитель А был 0,1% водный раствор трифторуксусной кислоты ( ТФК) и растворитель В включающий 0,1% трифторуксусный/90% ацетонитрил. Колонку уравновешивали со 100% А растворителем перед инъекцией. Каждый образец сырого яда (1 мл сырого яда-эквивалента) растворяли в 120 мл растворителя А и вводили 100 мл полученного раствора. Начальные условия поддерживали в течение 5 мин после инъекции, после чего был инициирован линейный градиент (0% В 5 мин, от 0 до 90% B в 100 мин, от 90 до 100% B в течение 5 мин, 100% B 5 мин, от 100 до 0% B в течение 5 мин). Вытекающий поток был разделен, 1/30 вводилась непосредственно в масс-спектрометр (20 мл/мин), а остаток (580 мл/мин) контролировали при 214 нм по УФ-поглощению на систему детектора ВЭЖХ. Анализ масс-спектрометрию проводили в режиме положительной ионизации на масс-спектрометре Quattro II, снабженным электрораспылителем источника ионов (Микромасса, Манчестер, Великобритания). Прибор работает под управлением системы данных Маssaа Lynx (Micromass) и эксперименты проводили путем сканирования с отношением массы к заряду (m/z) от 600 до 1800 в размере 0,16 скан/сек в течение всего хроматографического процесса. Масс-спектры, соответствующие каждому максимуму жидкостной хроматографии LC, присутствующие в полном ионном токе (TIC) хроматограммы были усреднены, чтобы улучшить статистику ионов, что приводит к лучшему определению молекулярной массы. Результаты и обсуждения
Анализ ВЭЖХ сырого яда на С8 или С18 колоннах дал аналогичные профили хроматографии. Профили яда тарантулов обычно показывают максимум поглощения УФ-излучением в 20-50% ацетонитрил зоне элюирования, соответствующих коротким десульфидовым мостикам пептидов различной полярности. Пептиды яда Pterinochilus элюировали позднее чем через 40-60 мин. Четкие различия появились сразу между образцами Pmu1-4 и образцом Pmu5 (Тан бабуина), которые показали очень четкий хроматографический профиль в пептидной элюированной зоне, а также наличие многочисленных мелких максимумов в элюированной зоне к 15-35 мин. Среди образцов Pmu1-4, образцы Pmu1 и Pmu4 (Usambara # 1 и # 2) виделись аналогии, но не идентичные профили, с сильными изменениями в относительных пропорциях максимума. Образцы Pmu2 (общий окрас) и Pmu3 (Момбаса) показали глобально аналогичные профили, с заметными качественными и количественными изменениями. Время удерживания были высоко воспроизведено на колонке С8, позволяя четко сравнить площади максимума и интенсивности, но были сдвинуты во время анализа методом жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии с использованием колонки С18.

Эти результаты были подтверждены с помощью анализа капиллярного зонного электрофореза (CZE), у изображений Pmu1, 3 и 4 были очень сходные профили, и у Pmu2 и Pmu5 определены очень различные электрофореграммы (данные не показаны). На основании данных ВЭЖХ уже можно было установить, отдельный образец Pmu5, в котором четко представлена другая таксономическая группа. Тем не менее, сложность пептидных профилей и возможных количественных изменений в белковых значениях исключает дальнейший вывод относительно таксономического статуса четырех других образцов, или наличие одинаковых компонентов. Поскольку яд тарантула очень сложные смеси, содержащие до 100 различных, но структурно родственных видов молекул, идентичность времени удерживания недостаточна для идентификации избирателей и, следовательно, образцы были подвергнуты масс-спектрометрическому анализу. Данные анализа масс-спектрометрии MALDI- TOF согласуются с этими наблюдениями.

Пептидные профили, полученные от образцов Pmu1 и Pmu4 были качественно очень сопоставимы (рис. 2), с изменениями в интенсивности максимумов (г-н 3596,6 ) и несколько качественных различий ( Mr 3853,9 , 4436,2 ) в малых составляющих. Предыдущий опыт работы с ядами тарантулов показывает, что этот уровень вариации согласуется с вариацией наблюдаемой между образцами яда от разных животных этих же видов ( P.Эскабас, неопубликованные данные), и что в целом сходство профиля согласуется с идентичностью видов для Pmu1 и Pmu4 . Pmu3 ( Момбаса ), показал профиль тесно связанный с Pmu1/4 , с важными изменениями в пропорциях обычных пептидов (г-н 3596,6 , 3726,5 , 3669,5, 4065,0, 4436,2), качественных различий для двух основных компонентов ( 3819,9 , 4110,5 ) и несколько незначительных ( 3698,1 , 3949,3 , 4260,5 , 4553,6 ).

Данные обоих анализов ВЭЖХ и масс-спектрометрии MALDI-TOF поддерживают существование двух очень тесно связанных, но различных систематических групп для «Usambara» и образцов «Момбаса». Хотя точный таксономический статус (видов, подвидов или местного населения) должен быть определен специалистами, биохимические популяции могут быть однозначно определены с помощью биохимических данных и, по меньшей мере, шести основных диагностических ионов. рис 1. рис 1 рис 2. рис 2 Профили как Pmu2 (распространенный окрас) и Pmu5 (Тан бабуина) явно отличались и однозначно выделялись друг от друга из Pmu1/4/3 группы. Образец Pmu2 обладал основными пептидами у которого ничего общего не было ни с Pmu 1/4 (Г-н 3639,0, 3969,3) или Pmu3 (г-н 3819,9) или обоими (г-н 3639,0, 3969,3, 4093,8), что свидетельствует о тесном филогенетическом родстве.

Тем не менее, Pmu2 характеризуется в частности наличием основных продуктов от Mr 4238,2, 4260,5, чего не найдено ни в одном из других образцов, и, очевидно, представляет другую группу. Здесь, анализ MALDI-TOFMS однозначно отделяет Pmu2 от других ядов значительным образом, чем в одиночку в ВЭЖХ анализе. Наконец, образец Pmu5 почти полностью отличается от всех остальных. Не наблюдалось общих пептидов у других образцов, за исключением одного от Mr 3819,9. При отсутствии морфологических данных, эти различия могут также быть совместимыми с различиями на уровне родов. В поддержку этой гипотезы, недавнее переосвидетельствование животного предположило, что это может быть у вида Pterinochilus hindei, что в итоге согласуется с нашими данными и появляется, чтобы подтвердить нашу аналитическую методологию, таким образом, исключая этот образец из группы «P. Murinus» и наиболее тесно связанных таксонов (RC Запад, личное сообщение). Чтобы подтвердить эти результаты, а также сравнить две различные методологии, масс-спектры жидкостной хроматографии / ионизации электроспреем были записаны и полученные Mr величины сравнивались с данными MALDI-TOF. Все ионные хроматограммы (TIC), полученные с помощью анализа жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии ионизацией электроспреем выявили пять четко различных профилей яда, показывая сильные качественные различия (рис. 1). Хотя образцы Pmu1 и Pmu4 были как предполагалось одинаковыми, их ионные хроматограммы заметно отличались в диапазоне 42.0-49.0 мин. Хотя эти два образца оказались идентичными по MALDI-TOFMS, LC / ESI-МС выявились дополнительные различия, а также наличие составляющих, характерных для Pmu1, не обнаруженного MALDITOFMS, на Mr 3696,5, 3816,2, 3819,9, 3916,2 и 3946,2.

С другой стороны, все другие пептиды, обнаруженные MALDI-TOFMS наблюдались, но в различных пропорциях. Этот результат можно объяснить различиями эффективности ионизации в различных условиях. Следует отметить, что белок, по-видимому, выше у Pmu1, по ВЭЖХ УФ-анализа, эти количественные различия могут частично объясняться неспособностью обнаружить некоторые компоненты в Pmu4. Другие пептиды были обнаружены в примерно сходных пропорциях в обоих образцах. В общем, больше ионов было обнаружено с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии, возможно из-за эффектов подавления в MALDI-TOFMS, где многие соединения в различных относительных количествах анализируются одновременно. Эти проблемы снижаются при хроматографическом разделении в анализе с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии. С одной стороны, MALDI-TOFMS менее чувствителен к примесям, а один молекулярный ион обычно наблюдается, что облегчает прямой анализ сложных смесей. Однако низкий динамический диапазон этих инструментов не позволяет обнаружить единичные ионы и более низкое разрешение не позволяет дискриминировать соединения с близкими молекулярными массами.

С другой стороны, электрораспыление масс-спектров обычно состоит из молекулярного конверта с 2-4 сигналами по отношению массы к заряду 600-1800. Анализ сложных смесей страдает от возможного присутствия солей, которые подавляют эффекты в процессе ионизации, в результате чего сложные масс-спектры, почти невозможно интерпретировать в случае прямого анализа сырого яда. Жидкостная хроматография/ масс-спектрометрия четко добавила ??информацию в анализ ядов у ‘Usambara’ посредством другой техники ионизации и дополнительного аналитического аспекта, обеспечиваемого с помощью муфты жидкостной хроматографии. рис 3. рис 3 Точно так же, больше ионов наблюдалось у Pmu3 на жидкостной хроматографии / ионизации элетроспреем масс-спектров, чем в MALDI-TOFMS, и в разных пропорциях. Некоторые из пептидов были характерны для Pmu3 против Pmu1 / 4 (г-н 3753,8, 4110,5, 4283,5, 4316,5). Пептид от Mr 4110,5 появляется, чтобы быть хорошим специфическим маркером этой таксономической группы, наблюдаемый в качестве основного и характерного продукта в MALDI-TOFMS и ESI-MS. Некоторые незначительные составляющие наблюдаемые в MALDI-TOFMS не были обнаружены с помощью ЖХ / ESI-MS (г-н 4260,5, 4508,1, 4553,6), это возможно, связано с различной эффективностью ионизации или совместного элюирования у основных компонентов яда.

Аналогичные результаты были получены для образца Pmu2, подтверждая филогенетическое отношение с Pmu1 / 4 и Pmu3. Дополнительная информация была получена путем выявления дополнительных молекулярных видов, и еще одной крупной конкретной составляющей (г-н 3965,2). Наблюдались диагностических виды препаратов в MALDI-TOFMS (г 4238,2, 4260,5, 4553,6, 4698,8). рис.3 Данные, полученные для Pmu5, были полностью схожи с результатами MALDI- TOFMS, с большинством молекулярных видов обнаруженных в одинаковых пропорциях. Два дополнительных маркера пептидов наблюдались у Mr 3710,0 и 3839,8. Кроме того, образец Pmu5 показал наличие самостоятельно заряженных ионов в 15.0-40.0 мин в зоне элюирования, где небольшие максимумы наблюдались при УФ-поглощении, предполагая присутствие низкомолекулярных соединений (г-н В целом, обе масс-спектрометрические аналитические методологии привели к тем же выводам относительно систематических различий между образцами: если образец ‘ «общий окрас» будет выбран в качестве наиболее вероятного животного, чтобы быть «общим» P. murinus , пробы «Момбаса» и «Усамбара красный» можно определить как тесно связанные виды или подвиды P. murinus, основанных на профилях яда и очевидных качественных различий в составе яда. По крайней мере, для «Usambara красного», окраска модели наблюдаемой на живых образцах также отличала его от Р. murinus «общей окраски». Крупномасштабный анализ МС должен будет определенно проверить метод и большие биологические данные необходимые для классификации этих животных.

Образец «Тан бабуин» представляет собой различные виды, и наши результаты показывают, что различия, наблюдаются и у других ядов наравне с различиями, наблюдаемыми между различными родами пауков. В соответствии с действующим таксономическим статусом этой группы, конкретных выводов сделать нельзя, и этот образец подтверждается переосвидетельствованием. Сравнение данных, полученных у обоих масс-спектрометрических методологий показало сходства и различия. Анализ ЖХ / ИЭР-МС не модифицирует выводы исследования по таксономии. Было обнаружено больше молекулярных видов, и дополнительное хроматографическое измерение позволяет различать пептиды с очень близкими молекулярными массами, и постоянством характеристик этих ядов. В образце Pmu1, наблюдались следующие пары молекулярных масс, с разным хроматографическим временем удерживания: MR 3696.5/3698.1, 3816.2/3819.9 и 3946.2/3949.3. Низкая массовая точность анализа по MALDI-TOFMS и перекрывающихся отношений массы к заряду не позволяет нам установить, что эти различия представляют различные молекулярные виды, в то время как ЖК-муфта однозначно отделила их с соответствующим временем удерживания 29.7/38.6, 47.0/40.7 и 46,4 / 46.0 мин, тем самым обеспечивая высокую точность анализа. Этот важный результат в поиске известных составляющих, которые могут быть скрыты в MALDI-TOF масс-спектрах через эффекты подавления или наличие других составляющих с аналогичными молекулярными массами. Наши результаты также показывают, что пептидные токсины, содержащиеся в ядах тарантулов вписываются в очень узкий диапазон масс, ок. 3500 до 4900 дальтон, эта проблема анализа MALDI-TOF, которую частично решают с помощью ЖХ/МС. Как отмечалось в предыдущих исследованиях на ядах от Brachypelma, 31 анализ молекулярных масс против времени удерживания пептида на обращенной фазе столбцов не показывают корреляцию (рис. 3). Колонка удержание, следовательно, не является показателем размера пептида и не может быть использована для прогнозирования потенциально фармакологической цели, как и у ядов скорпионов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Наши результаты показывают, что обе методологии MALDI- TOFMS и LC/ESI-МС могут быть успешно использованы для анализа ядов пауков. Эти яды представляют собой сложные смеси структурных и химических гомологичных пептидов. ЖХ/ESI-МС оказалась адекватным средством, добавив дополнительное хроматографическое измерение, необходимое для разделения родственных молекулярных частиц, и повысить точность и четкость дактилоскопии яда. Однако, чем больше время анализа и сложность ионных хроматограмм тем меньше полезное применение этой методики в особо сложных образцах с ограниченным их числом, как в настоящем исследовании. MALDITOFMS, из-за низких требований к количеству проб и быстроте анализа, останется главным инструментом для быстрой идентификации большого количества образцов и систематических исследований. Эффективность методики может быть улучшена за счет использования различных матриц, а также возможности использования отрицательной ионизации, чтобы получить дополнительную информацию. Применение обеих методик, к ядам от Pterinochilus зр. продемонстрировало потенциал методологии для современной таксономии и ее способности тонко различать тесно родственные образцы от живых животных.

Эта методология будет применяться к большему числу видов тарантулов с целью получения нового взгляда на сложную таксономию и филогенез этой группы. Фармакологическое исследование этих ядов будет способствовать точной идентификации образца и быстрому обнаружению ранее выявленных пептидных токсинов. Благодарности Мы хотели бы выразить признательность г-же М. Hisada за помощь в MALDITOF масс-спектрометрии, и г-ну RC Вест за идентификацию образцов и полезные советы в таксономии тарантулов.

Список литературы
1. Olivera BM, Hillyard DR, Marsh M, Yoshikami D, Trends
Biotechnol. 1995; 13: 422.
2. Newcomb R, Szoke B, Palma A, Wang G, Chen X, Hopkins W,
Cong R, Miller J, Urge L, Tarczy-Hornoch K, Loo JA, Dooley DJ,
Nadasdi L, Tsien RW, Lemos J, Miljanich G, Biochemistry 1998;
37: 15353.
3. Swartz KJ, Mackinnon R, Neuron 1995; 15: 941.
4. Lampe RA, Defeo PA, Davison MD, Young J, Herman JL, Spreen
RC, Horn MB, Mangano TJ, Keith RA, Mol. Pharmacol. 1993; 44:
451.
5. Haag AM, Taylor SN, Johnston KH, Cole RB, J. Mass Spectrom.
1998; 33: 750.
6. Welham KJ, Domin MA, Scannell DE, Cohen E, Ashton DS,
Rapid Commun. Mass Spectrom. 1998; 12: 176.
7. Wang Z, Russon L, Li L, Roser DC, Long SR, Rapid Commun.
Mass Spectrom. 1998; 12: 456.
8. Arnold RJ, Reilly JP, Rapid Commun. Mass Spectrom. 1998; 12:
630.
9. Basile F, Beverly MB, Abbas-Hawks C, Mowry CD, Voorhees KJ,
Hadfield TL, Anal. Chem. 1998; 70: 1555.
10. Chong BE, Wall DB, Lubman DM, Flynn SJ, Rapid Commun.
Mass Spectrom. 1997; 11: 1900.
11. Holland RD, Wilkes JG, Rafii F, Sutherland JB, Persons CC,
Voorhees KJ, Lay JO Jr., Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996;
10: 1227.
12. Krishnamurthy T, Ross PL, Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996;
10: 1992.
13. Liang X, Zheng K, Qian MG, Lubman DM, Rapid Commun. Mass
Spectrom. 1996; 10: 1219.
14. Krishnamurthy T, Ross PL, Rajamani U, Rapid Commun. Mass
Spectrom. 1996; 10: 883.
15. Fox A, Black GE, Fox K, Rostovtseva S, J. Clin. Microbiol. 1993;
31: 887.
16. Aluyi HS, Boote V, Drucker DB, Wilson JM, J. Appl. Bacteriol.
1992; 72: 80.
17. Couderc F, De Briel D, Demont N, Gilard V, Prome JC, J. Gen.
Microbiol. 1991; 137: 1903.
18. Brondz I, Olsen I, J. Clin. Microbiol. 1991; 29: 183.
19. Roda A, Gioacchini AM, Seraglia R, Montagnani M, Baraldini M,
Pedrazzini S, Puricelli M, Traldi P, Rapid Commun. Mass
Spectrom. 1997; 11: 1297.
20. Stocklin R, Savoy L-A, Toxicon 1994; 32: 408.
21. Stocklin R, Mebs D, Boulain J-C, Panchaud P-A, Virelizier H,
Gillard-Factor C. In Protein and Peptide Analysis: Advances in the
Use of Mass Spectrometry, Methods in Molecular Biology, John
Chapman, 1999; in press.
22. Sweetman GM, Garner GV, Gordon DB, Tetler L, Theakston RD,
Rapid Commun. Mass Spectrom. 1992; 6: 724.
23. da Silva Junior NJ, Griffin PR, Aird SD, Comp. Biochem. Physiol.
B 1991; 100: 117.
24. Perkins JR, Parker CE, Tomer KB, Electrophoresis 1993; 14: 458.
25. Perkins JR, Smith B, Gallagher RT, Jones DS, Davis SC, Hoffman
AD, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1993; 4: 670.
26. Nakagawa Y, Sadilek M, Lehmberg E, Herrmann R, Moskowitz H,
Lee YM, Thomas BA, Shimizu R, Kuroda M, Jones AD,
Hammock BD, Arch. Insect Biochem. Physiol. 1998; 38: 53.
27. Romi-Lebrun R, Martin-Eauclaire MF, Escoubas P, Wu FQ,
Lebrun B, Hisada M, Nakajima T, Eur. J. Biochem. 1997; 245:
457.

Перевод подготовлен для сайта http://exzotik-home.com